FLANDERS' FOOD RADAR

Een veilige challenge test voor Clostridium botulinum dankzij atoxigene mutanten

Microbiologische challenge testen vormen een essentieel onderdeel bij nieuwe productontwikkeling. Voor toxine producerende micro-organismen geldt hier het hoogste niveau van bioveiligheid. Deze testen zijn niet vanzelfsprekend en dat kan een belemmering vormen voor een vlotte productontwikkeling. Niet-toxische mutanten bieden echter uitkomst - met dank aan gentechnologie.

CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Clostridium botulinum is een Gram-positieve, anaërobe sporenvormende, staafvormige bacterie die potentieel het botuline neurotoxine  kan produceren. Dit micro-organisme is in de natuur terug te vinden in zuurstofarme milieus (bodemsedimenten met rottend organisch materiaal, slik van waterlopen,…). Zijn sporen kunnen accidenteel voedingsproducten contamineren. Wanneer deze niet geëlimineerd worden door aangepaste processing en/of hun uitgroei onvoldoende verhinderd wordt, leidt dit tot voedselgerelateerd botulisme: een uitzonderlijk, maar een ernstig klinisch syndroom met verlammingsverschijnselen.

Historisch gezien is de aandacht vooral uitgegaan naar mesofiele Clostridium botulinum stammen (die geklasseerd worden onder ‘Groep I’, met optimale groei bij 35° tot 40° C), waarbij men vooral beducht is voor de hitte-resistente sporen die ze produceren. Om de voedselveiligheid te garanderen werd decenia geleden de ‘botuline-kook’ ontwikkeld (121°C gedurende 3 min, of equivalente letaliteit) die toegepast wordt bij het inblikproces van zwak-zure voedingsproducten (pH ≥ 5). Met de opkomst van milder geproceste en (vacuüm en MAP verpakte) koelverse voedingsproducten (om aan de consumentenwensen te beantwoorden) dient evenwel een andere groep van Clostridium botulinum stammen onder controle gehouden te worden. Namelijk deze van ‘Groep II’, welke psychrotroof zijn (minimale groeitemperatuur 3°C) en toxine kunnen produceren bij koelkasttemperaturen. Hun sporen zijn wat minder hitte-resistent en richtlijnen om het risico voor deze producten te beperken, kwamen in een eerder Food Radar artikel aan bod (december 2008).

CHALLENGE TESTEN

Microbiologische challenge testen zijn een middel om na te gaan of er groei of inhibitie optreedt van kiemen en pathogenen in voedingsmiddelen. Dergelijke testen worden gebruikt om de voedselveiligheid na te gaan van nieuwe producten, producten waarvan de samenstelling substantieel gewijzigd wordt (bv. concentratieverlaging of vervanging van bewaarmiddelen) evenals van aangepaste of nieuwe conserveringsprocessen (bv. hoge hydrostatische druk, pulsed electric field). Het uitvoeren van dergelijke testen met toxine-producerende micro-organismen dient te beantwoorden aan de strengste normen op het vlak van bioveiligheid en bioterrosrisme. Voor anaërobe micro-organismen komt daar nog bij dat er in zuurstofloze omstandigheden gewerkt dient te worden, wat een gespecialiseerde aanpak vraagt. Deze testen zijn dus niet vanzelfsprekend. Gezien het toenemende belang van 'Groep II' Clostridium botulinum stammen is er nood aan dergelijke challenge testen. Maar de specificaties en restricties vormen een belemmering om deze grootschalig te gaan toepassen. Niet-toxische mutanten, waarmee veilig gewerkt kan worden en die in hun eigenschappen zo goed als volledig gelijken op toxine-producerende Clostridium botulinum stammen zouden hier verandering in kunnen brengen.

NIET-TOXISCHE (ATOXIGENE) CLOSTRIDIUM BOTULINUM MUTANTEN

Het botuline toxine is een 150-kDa proteïne met een zink-afhankelijke endopeptidase werking. In het genoom van Clostridium botulinum wordt het gecodeerd door het 'bont' gen. Afhankelijk van de Clostridium botulinum stam codeert dit gen voor één van de zeven typen (A, B, C, D, E, F and G) botuline (waarvan enkel A, B, E en F menselijk botulisme veroorzaken). In sommige Clostridium botulinum stammen zijn meerdere toxinegenen aanwezig, en zij produceren dan verschillende botuline types. Voor groep II stammen zijn echter nog nooit meerdere toxinegenen in één stam aangetoond. Er zijn van-nature niet-toxische Clostridium mutanten gevonden, waarin het toxinegen niet aanwezig is. Doch deze bleken geen volmaakt ‘surrogaat’ organismen te zijn voor toxine producerende Clostridium botulinum stammen omdat bepaalde van hun eigenschappen (vooral van hun sporen) significant verschillen. Daarnaast is tot op heden niet duidelijk hoe genetisch verwant deze stammen zijn met Clostridium botulinum, waardoor het gedrag van deze niet-toxische stammen moeilijk voorspeld kan worden in condities die nog niet getest werden.

Een alternatief is om, met behulp van recente gentechnologische ‘tools’, niet-toxische mutanten te creëren door in toxine producerende Clostridium botulinum stammen het bont gen in het genoom uit te schakelen. In een recent artikel rapporteerden Clauwers et al. (2016) hoe ze dit via twee strategieën voor elkaar kregen: door enerzijds een DNA insertie in het bont gen en anderzijds een uitwisseling van het bont gen met een Erythromycine resistentiegen (zie kader). Beide strategieën slaagden in hun opzet om het bont gen uit te schakelen. De eerste strategie heeft evenwel als nadeel dat er een risico is dat het insert zichzelf spontaan verwijderd (omwille van zijn ‘mobiele’ eigenschap) en dus de toxine status zich terug herstelt, terwijl de tweede strategie het voordeel biedt dat het bont gen volledig verwijderd is uit het genoom en de Erythromycine resistentie ervoor zorgt dat men zeer makkelijk selectieve plaattellingen kan uitvoeren. 

EIGENSCHAPPEN VAN NIET-TOXISCHE CLOSTRIDIUM BOTULINUM MUTANTEN

Groei eigenschappen van de atoxigene mutanten onder optimale en stress condities, evenals sporulatie efficiëntie bleken niet aangetast (behoudens een klein verschil in groei bij 2.3% NaCl). Ook de hitte resistentie van de sporen was vergelijkbaar met die van wild type Clostridium botulinum NCTC 11219 op een klein verschil in resistentie bij 70°C na (Figuur 1).

 

Figuur 1 Hitte inactivatie van sporen van de mutanten en wild type Clostridium botulinum NCTC 11219, bij 70°C en 73°C, uitgedrukt in decimale reductie tijden (D70 en D73).

 

BRONNEN:

- Clauwers C., Vanoirbeek K., Delbrassinne L., Michiels C.W. (2016). Construction of nontoxigenic mutants of nonproteolytic Clostridium botulinum NCTC 11219 by insertional mutagenesis and gene replacement . Appl. Environ. Microbiol. 69: 4029-4036.

- Preventie en snelle detectie van Clostridium botulinum. Food Radar Artikel, 11 december 2008.

Nuttige links

Reacties