FLANDERS' FOOD RADAR

De ene Listeria monocytogenes is de andere niet

    Voor COVID-19 zijn we ondertussen vertrouwd met het voorkomen van tal van varianten en kennen we het belang om deze te kunnen onderscheiden. Bij voedselpathogenen zoals Listeria monocytogenes is dat net zo het geval. De variatie heeft er zich zelfs al straffer doorgezet: genetische typering laat zien dat deze bacteriesoort een verzameling van klonale clusters is die evolutionair vrijwel apart staan van elkaar en zich anders gedragen ten aanzien van de omgeving, levensmiddel en gastheer. Deze kennis vertoont nog hiaten, maar op termijn evolueren we misschien naar een meer op maat gerichte aanpak van Listeria monocytogenes .

    LISTERIA MONOCYTOGENES ALS VOEDSELPATHOGEEN

    Listeria monocytogenes is een grampositieve, facultatief anaerobe, psychrotolerante, niet-sporevormende bacteriesoort die wijdverspreid voorkomt in het milieu en via gecontamineerd voedsel overgedragen kan worden naar de mens. Als darmbacterie kan het listeriose veroorzaken. Deze infectieziekte kan verschillende ziektebeelden veroorzaken, gaande van milde gastro-enteritis over griepachtige aandoeningen tot sepsis en meningitis. Bepaalde bevolkingsgroepen zijn gevoeliger voor het ontwikkelen van ernstige vormen van listeriose, namelijk zwangere vrouwen, oudere personen en personen met een verzwakt immuunsysteem. Naast verschillen in gevoeligheid van de gastheer zijn er ook verschillen in virulentie tussen verschillende Listeria monocytogenes stammen. Dit verklaart waarom de aanwezigheid van de bacterie hoog is, maar de ziekte listeriose weinig voorkomt. Het sterftecijfer in 2017 binnen de EU was 13,8% voor de 1633 gerapporteerde gevallen met een gekende afloop (EFSA 2018). Consumenten dienen met het oog op Listeria monocytogenes vooral alert te zijn bij het bewaren en consumeren van ‘Ready-To-Eat’ (RTE) producten en hun gebruik bij het bereiden van maaltijden. Aanbevelingen zijn beschikbaar op de website van het FAVV.

    Listeria monocytogenes voedselinfecties vallen niet te koppelen met één specifiek type voedsel. De meeste incidenties doen zich voor bij rauwe of ondergepasteuriseerde melk, ijs, kaas (vooral zachte), gerookte vis, zeevruchten, vlees(producten), salades en rauwe groenten.

    DE ENE LISTERIA MONOCYTOGENES IS DE ANDERE NIET

    Epidemiologisch onderzoek van Listeria monocytogenes uitbraken noopte tot de ontwikkeling van analytische methoden om stammen te kunnen onderscheiden. Dit leidde tot de identificatie van stammen op basis van fenotypische kenmerken (somatische en flagellaire antigenen) en hun indeling in 13 serovars. Klinische isolaten bleken bijna altijd tot serotype 1/2a, 1/2b of 4b te behoren. Multi enzym elektroforese, ‘ribotyping’ en PCR-restrictie fragment lengte polymorfisme (van virulentiegenen hly, actA en inlA) onderscheidden drie evolutionaire afstammingslijnen (‘lineages’) in Listeria monocytogenes (Wiedmann et al. 1997). Begin jaren 2000 maakten snelle genetische typeringstechnieken opgang. Als alternatief voor serotypering werd een PCR analyse uitgewerkt die de soort onderverdeelt in 5 genoserogroepen: IIa (serovars 1/2a en 3a), IIb (serovars 1/2b en 3b), IIc (serovars 1/2c en 3c), IVb (serovars 4b, 4d en 4e) en L (overige serovars). Een verdere graad van onderscheiding op stamniveau kon bekomen worden op basis van ‘pulsed-field gel electrophoresis’ (PFGE, wat ‘pulsotype’ profielen oplevert). De meest recente trend is om DNA sequentie-analyse in te zetten om Listeria monocytogenes stammen te onderscheiden. Zo worden bij MLST (‘multilocus sequence typing’) zeven uitgekozen huishoudgenfragmenten PCR geamplificeerd en gesequeneerd (zie MLST scheme Institut Pasteur). MVLST (‘multi virulence locus sequence typing’) vormt hierop een variante, waarbij zes virulentiegenen (prfA, lisR, inlC, inlB, dal en clpP) geviseerd worden (Yin et al. 2015). MLST wordt het meest algemeen toegepast en deelt Listeria monocytogenes op in ‘clonal complexes’ (CCs), die apart van elkaar staan en evolueren. Ook zijn door de universele toepassing van deze typering al enkele CCs geïdentificeerd die wereldwijd voorkomen (Figuur 1).

     

    Figuur 1. MVLST gebaseerde clusteranalyse (op basis van DNA sequentie verwantschap) uitgevoerd op 82 Listeria monocytogenes isolaten uit diverse bronnen (China en diverse landen): menselijke en dierlijke listeriose uitbraken (rood), sporadische menselijke en dierlijke listeriose gevallen (paars), voeding (groen) en onbekende oorsprong (zwart). Dezelfde isolaten werden ook MLST getypeerd en 52 ervan bleken types te zijn die wereldwijd voorkomen (‘clonal complexes’ CC1, CC2, CC3, CC4, CC8, CC9). Tussen haakjes: het overeenkomstige serotype [Bron: Yin et al. 2015, Microbiological Research 175, 84-92]

    Toepassing van deze genotyperingen op steeds meer Listeria monocytogenes isolaten geeft niet enkel een steeds beter zicht op de biodiversiteit en populatiestructuur van Listeria monocytogenes (indeling in klonale clusters) maar ook inzicht in de ecologische niche voorkeur (omgeving of gastheer), het ecologisch spectrum (omgevings- of gastheerdiversiteit), de pathogeniteit en het epidemiologisch vermogen van de stammen binnen deze clusters. In een uitgebreide, diepgaande analyse van een aantal belangrijke CCs kwamen Maury et al. (2019) tot volgende interessante bevindingen en afgeleide stellingen:

    • CC1 is een hypervirulente kloon die aangepast is om het maag-darmstelsel van zoogdieren te koloniseren (onder andere geholpen door zijn zoutresistentie). Recent onderzoek suggereert dat deze kloon bij melkvee een verspreidingscyclus kent die loopt over een zogenaamde oraal-fecale route. Ook uiers, melk en melkkoeltanks kunnen daarbij accidenteel gecontamineerd worden, waardoor deze bacteriën voornamelijk via zuivelproducten de weg weten te vinden naar de mens. Als hypervirulente kloon kan hij listeriose veroorzaken bij de mens, bij runderen is hij sterk geassocieerd met neurolisteriose.
    • CC4 is eveneens een hypervirulente, eerder gastheer-aangepaste kloon waarvan de isolaten ook voornamelijk uit zuivelproducten afkomstig zijn.
    • CC9 is een hypovirulente kloon die bij voorkeur een saprofytisch bestaan leidt in productieomgevingen waar geslacht wordt of vers vlees wordt verwerkt. Vandaaruit kunnen deze bacteriën vlees contamineren, maar blijken verder stroomafwaarts in de vleesverwerkende keten geen gelegenheden te vinden om zich vervolgens ook in die omgevingen te ‘nestelen’. Ze leiden enkel tot listeriose bij personen met een sterk verzwakt immuunsysteem. De tolerantie van deze bacteriën tegen residu’s van het ontsmettingsmiddel benzalkonium chloride (quaternaire ammoniumzouten) na reiniging en desinfectie en hun vermogen tot biofilmvorming dragen bij tot het persistent karakter van deze stam.
    • Ook CC13, CC31 en CC121 zijn hypovirulente klonen waarvan de meeste isolaten een zekere tolerantie tegen benzalkonium chloride vertonen door de aanwezigheid van tolerantiegenen qac, bcrABC, emrC, emrE, qacC, and qacA, die via plasmiden tussen isolaten binnen een kloon uitgewisseld kunnen worden.
    • CC14 is een hypovirulente kloon die efficiënt biofilmen vormt.
    • CC2 en CC6 zijn klonen die minder uitgesproken gastheer-aangepast en minder hypervirulent zijn dan CC1 en CC4, maar wel beter aangepast aan voedingsproductieomgevingen. Isolaten van deze klonen komen vaak van vlees(producten). Ze hebben een deletie in virulentiegen InlA. In deze klonen circuleren een aantal van de hogervernoemde tolerantiegenen.

    Nog meer inzicht in de biologische levensstijl van Listeria monocytogenes klonen valt te verwachten van ‘core genome’ MLST (cgMLST), waarbij meer dan 1.800 ‘DNA sequence targets’ van Listeria monocytogenes isolaten vergeleken worden (Chen et al. 2016). Deze ‘DNA sequence targets’ worden geëxtraheerd uit ‘whole genome sequencing’ (WGS) data van klonen. Samen met geassocieerde metadata kunnen hierop dan ‘genome-wide association’ studies (GWAS) uitgevoerd worden om genen te vinden die geassocieerd zijn met virulentie, gastheer aanpassingen, omgevingsstress resistentie, etc. Op hun beurt kunnen deze dan weer zicht bieden op bacteriële factoren die de pathogeniteit en het epidemiologisch vermogen van stammen kunnen verklaren.

    DNA-GEBASEERDE TYPERING VOOR HET ZOEKEN NAAR BESMETTINGSBRONNEN

    Als onderdeel van hun HACCP-plan (gericht op de procesbeheersing) voeren levensmiddelenfabrikanten, die producten produceren met potentieel risico op Listeria monocytogenes, planmatig bemonsteringen uit in de productieomgeving (vaste monsternamepunten en testfrequenties) voor controle op de mogelijke aanwezigheid van Listeria monocytogenes. EFSA beveelt aan om de monsters rechtstreeks op Listeria monocytogenes te testen volgens protocol EN ISO 11290 deel 1 (detectieprotocol), eerder dan ze te testen op indicatororganismen. Als de aanwezigheid van Listeria monocytogenes wordt vastgesteld, dan is het zaak om de oorzakelijke bron van deze contaminatie te achterhalen. Voor dergelijke ‘source tracking’ is DNA-gebaseerde typering onontbeerlijk. Dit werd mooi geïllustreerd in het SAFEMEAT project.

    Als onderdeel van één van de SAFEMEAT studiecases werd in een slachthuis op zoek gegaan naar de bron van een Listeria monocytogenes contaminatie van runderkarkassen. Een uitgebreide monitoring bracht aan het licht dat Listeria monocytogenes aanwezig was op alle binnenkomende runderen (hun vacht) en dat de messen die gebruikt werden bij het onthuiden in 10% van de staalnames gecontamineerd werden bij het aansnijden van de huid (en daarna weliswaar ontsmet). Dit suggereerde eerst dat de problematiek veroorzaakt zou zijn door kruiscontaminatie van de huid van de runderen, via (onzorgvuldig ontsmette) messen naar de karkassen. PFGE genotypering van de Listeria monocytogenes isolaten lieten echter zien dat isolaten van de karkassen consistent CC9 types waren terwijl dat type zelden aanwezig bleek op de runderen of de messen (Figuur 2). Dit toonde aan de Listeria monocytogenes contaminatie van de karkassen in het slachthuis niet lag aan een onzorgvuldig onthuidingsproces maar te wijten zou moeten zijn aan contaminatie vanaf een persistente CC9 bron verderop in het proces. Met het vinden van CC9 in de karkassplitter werd de bron gelokaliseerd en kon gefocust worden op een plaatselijke remediëring van het contaminatieprobleem (Demaître et al. 2021).

     

    Figuur 2. Resultaat van de genotypering van Listeria monocytogenes isolaten van runderen en hun overeenkomstige karkassen en van omgevingsstalen in een slachthuis. De staalnames liepen over 3 dagen, waarbij telkens 10 runderen/karkassen bemonsterd werden. Messen, uithaalbordes en lucht (ter hoogte van de onthuidingsstap) werden op drie momenten in de dag bemonsterd (T0, T1 en T2). Elke kleur staat voor een bepaald CC type (bv. Rood = CC9, grijs = PFGE genotypes die toegewezen werden aan een minder frequent voorkomende CC of die niet toegewezen konden worden aan een gekende CC). [Bron: Demaître et al. 2021, Meat Science 175: 108450]

    Bovenop de mogelijkheid van ‘source tracking’ kan het identificeren van Listeria monocytogenes isolaten in levensmiddelenprocesomgevingen tot op CC niveau een meerwaarde leveren voor het bepalen van een remediëringsstrategie. In die strategie kan immers rekening gehouden worden met de eigenschappen van de desbetreffende kloon (bijvoorbeeld biofilmvormend vermogen, persistentie, virulentie, robuustheid). In het bovenstaande voorbeeld zou alleen al uit de vaststelling van de aanwezigheid van CC9 kunnen geconcludeerd worden dat de contaminatieproblematiek niet voorkomt uit kruiscontaminatie vanaf de grondstof maar vanuit een gevestigde contaminatie van deze persistente kloon in de procesomgeving. Verder kan, eens de bron gelokaliseerd is, een reinigings- en ontsmettingsprotocol toegepast worden dat rekening houdt met een zekere resistentie tegen quaternaire ammoniumzouten en het biofilmvormend vermogen van deze kloon. Naarmate de kennis over de biologische levensstijl van de klonen vordert, zullen in de toekomst Listeria monocytogenes incidenties bijgevolg steeds meer op maat aangepakt kunnen worden. 

    BRONNEN

    Chen Y, Gonzalez-Escalona N, Hammack TS, Allard MW, Strain EA and Brown EW. (2016). Core Genome Multilocus Sequence Typing for identification of globally distributed clonal groups and differentiation of outbreak strains of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology 82: 6258 –6272.

    Demaître N, De Reu K, Haegeman A, Schaumont D, De Zutter L, Geeraerd A and Rasschaert G. (2021). Study of the transfer of Listeria monocytogenes during the slaughter of cattle using molecular typing. Meat Science 175: 108450

    EFSA (2018). The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2017. EFSA Journal. 16(12), e05500. doi: 10.2903/j.efsa.2018.5500. 

    Maury MM, Bracq-Dieye H, Huang L, Vales G, Lavina M, Thouvenot P, Disson O, Leclercq A, Brisse S and Lecuit M. (2019). Hypervirulent Listeria monocytogenes clones’ adaption to mammalian gut accounts for their association with dairy products. Nature Communications 10: 2488.

    SAFEMEAT: Strategieën voor het beheersen van pathogenen en gebruik van indicatorkiemen in de vleesketen. Flanders’ FOOD project 2017-2020, uitgevoerd door ILVO, KU Leuven, UGent en Flanders’ FOOD. 

    Wiedmann M, Bruce J, Keating C, Johnson A, McDonough P and Batt C. (1997). Ribotypes and virulence gene polymorphisms suggest three distinct Listeria monocytogenes lineages with differences in pathogenic potential. Infection and Immunity 65: 2707-2716

    Yin Y, Tan W, Wang G, Kong S, Ahou X, Zhao D, Jia Y, Pan and Jiao X. (2015). Geographical and longitudinal analysis of Listeria monocytogenes genetic diversity reveals its correlation with virulence and unique evolution. Microbiological Research 175, 84-92.

    NUTTIGE LINKS

    FAVV - Listeria monocytogenes: algemene informatie

    Institut Pasteur MLST scheme

    Nuttige links