Projecten

KILLFILM

Controle van biofilmvorming in de productieomgeving om een langere shelf life te kunnen garanderen

Opportuniteit & probleemstelling

Groei van pathogenen en bederfflora op wanden van processing apparatuur zal aanleiding geven tot vorming van biofilmen, die vaak zeer moeilijk of niet te verwijderen zijn door normale reinigings- en desinfectieprocedures. De aanwezigheid van dergelijke biofilmen zal een directe invloed hebben op de houdbaarheid van levensmiddelen door nabesmetting. De meeste voedingsindustrieën hebben last van typische nabesmettingen (door lactobacilli, bacilli, pseudomonas,…), die met een regelmaat van een klok terug de kop opsteken met verkorting van de shelf life van het product tot gevolg. Uit recente literatuur blijkt dat biofilmen veel meer dan de normale vrij voorkomende micro-organismen (planktonische micro-organismen) verantwoordelijk zijn voor deze persisterende besmettingen. Daarnaast zullen bepaalde pathogenen zoals Listeria ssp. frequent in voedingsproducten opduiken ondanks regelmatige en correct uitgevoerde reiniging en desinfectie. Deze pathogenen kunnen zich schuil houden in een biofilm waar ze samen met bederforganismen voor nabesmetting zorgen, wat uiteindelijk aanleiding zal geven tot recall van producten en melding van een incident.

Biofilmen zullen in de meeste voedingsbedrijven aanwezig zijn zonder dat het bedrijf zich hiervan terdege bewust is. Ze worden voornamelijk aangetroffen in slicingmachines, dicingmachines, verpakkingsmachines, doseer- en afvulapparatuur, pompen en mengapparatuur en dit zowel op roestvrij staaloppervlakten als elastomeren (rubbers) en plastics. Deze niet-metaal materialen worden daarnaast ook vaak aangetroffen in transportbanden, containers, dichtingen en snijtafels.

Wat verstaan de wetenschappers nu onder biofilm? Een biofilm is een microbiële gemeenschap, die zich vastgehecht heeft aan een oppervlak en als bescherming zich ingebed heeft in een matrix van extracellulaire polymere bestanddelen. Deze laag bestaat naast eiwitten en DNA hoofdzakelijk uit extracellulaire polysacchariden (EPS) (Lequette et al., 2010) en deze maken dat de bacteriën in de biofilm meer resistent zijn tegen normale reiniging- en desinfectiebehandelingen dan de normale vrij levende planktonische cellen (Chmielewski & Frank, 2003; Behnke et al., 2011; Weiss & Hammes, 2005).

De hogere resistentie van biofilmen tegen desinfectantia is te wijten aan meerdere factoren :

1) gelimiteerde diffusie van desinfectantia en reinigingsmiddelen doorheen de extracellulaire koolhydraatcomplexen van de biofilm ;

2) de ontwikkeling van resistente fenotypes door resistentiegentransfer ;

3) ontwikkeling van kruisresistentie tegen antimicrobiële middelen, surfactantia en desinfectantia ;

4) de aanwezigheid van persistentere cellen in de biofilm

5) de fysiologische heterogeniteit van de microbiële populatie in de biofilm (Jahid & Ha, 2012).

De structuur van de biofilm matrix is sterk variërend en hangt af van de aanwezige microbiële cellen en hun fysiologische status, de beschikbare nutriënten en omgevingscondities en de ouderdom van de biofilm (Branda et al., 2005; Ivleva et al., 2009). Informatie omtrent de microbiële en chemische samenstelling, de structuur van de EPS matrix en het mechanisme van biofilmvorming (op moleculair niveau) is noodzakelijk om het gebruik van desinfectantia en reinigingsproducten te optimaliseren en de juiste strategie voor reiniging en desinfectie te kunnen kiezen tegen de laagste prijs.

Innovatie in verband met het opsporen en verwijderen van biofilmen is noodzakelijk gezien de huidige technieken en procedures vaak ontoereikend zijn. Het efficiënt verwijderen van biofilmen zal een verbetering van de houdbaarheid met zich meebrengen en de frequentie van incidentele besmettingen met pathogenen verlagen. Om dit te kunnen realiseren is het noodzakelijk om meer inzicht te verwerven in de microbiële en chemische samenstelling van de biofilmen welke typisch voorkomen in de verschillende voedingssectoren.

onderzoek

Werkpakket 1: Opsporing en karakterisering van biofilmen in diverse voedingssectoren

Biofilmen zijn sectorspecifiek, waardoor verschillen in samenstelling tussen sectoren en bedrijven kunnen verwacht worden. In dit werkpakket is het de bedoeling om bij de deelnemende levensmiddenbedrijven de samenstelling van de biofilmen in kaart te brengen. De bemonsteringstechnieken (zoals UV detectie, swabanalyses, kleurreacties, sensoren, probes…) zullen in eerste instantie dienen geëvalueerd te worden om een gefundeerde keuze te maken welke voor onze toepassing het meest geschikt is.

Voor de opsporing van de biofilmen zelf zullen bij de bedrijven biofilmen bemonsterd worden in de ganse productielijn en de omgeving. Deze bemonstering zal herhaald worden gedurende de looptijd van het project (werkpakket 3) om persistentie of evolutie van biofilmen in kaart te brengen. De bekomen monsters zullen zowel microbiologisch als chemisch gekarakteriseerd worden. Micro-organismen geïsoleerd uit producties met verlaagde houdbaarheid zullen vergeleken worden met de organismen teruggevonden in de biofilmen. Een aantal van deze micro-organismen zijn reeds in collectie aanwezig.

Microbiologische karakterisatie zal toelaten kennis te verwerven omtrent de (sectorspecifieke) microbiële gemeenschap aanwezig in de biofilmen en de wijziging in samenstelling ervan in functie van de tijd. Hierdoor zal inzicht verkregen worden in welke (groep van) micro-organismen in de biofilm domineren en aan de basis liggen voor mogelijke problemen in het bedrijf. Hiervoor zal aan de hand van DGGE analyses per staalname een DNA fingerpint genomen worden en waar nodig zal een verdere identificatie van de dominante DGGE-banden via sequentieanalyse uitgevoerd worden. Tot slot zullen een aantal terugkerende en dominante micro-organismen uit geselecteerde biofilmen opgekweekt worden, zodat deze als modelorganismen kunnen fungeren voor Werkpakket 2.

Naast microbiologische identificatie is ook de kennis van de chemische samenstelling van de EPS matrix belangrijk, om gerichte reiniging en desinfectiemethoden te kunnen toepassen. Chemische karakterisatie houdt de bepaling in van het totaal gehalte eiwitten, koolhydraten, DNA, en eventueel een overzicht van de aanwezige metalen in de biofilm. De polymere koolhydraatfractie zal meer in detail bestudeerd worden naar samenstelling.

Werkpakket 2: Mechanisme van biofilmvorming

In dit onderdeel wordt onderzoek uitgevoerd naar de fysicochemische, biochemische en genetische factoren die de groei en onderhoud van de biofilm beïnvloeden en bepalen. Het onderzoek spitst zich in eerste instantie toe op de ontwikkeling van mono-species biofilmen. Bij vroeger onderzoek zijn diverse organismen geïsoleerd (lactobacilli, bacilli, Candida), die betrokken waren bij persisterende besmettingen en die aanleiding gaven tot biofilmvorming. De reproduceerbare aanmaak van biofilmen op diverse ondergronden (roestvrij staal, rubber en plastiek) met deze organismen wordt bestudeerd in 1 en 10 liter fermentors. Het doel is een reproduceerbaar model voor biofilmvorming op te maken dat kan gebruikt worden om de expressie van de genen in de biofilmen op te volgen. Eénmaal een reproduceerbare mono-species biofilm gecreëerd is met de huidige isolaten, kan ook Listeria spp. toegevoegd worden tijdens de biofilmvorming om na te gaan in welke mate dit organisme bescherming ondervindt van een biofilm. De reproduceerbaarheid van de aanmaak van een bi-species biofilm met Listeria spp. zal bestudeerd worden. In een later stadium van het project zullen de organismen (bederfflora en pathogenen) geïsoleerd in werkpakket 1 toegepast worden in het modelsysteem om na te gaan in welke mate andere types biofilmen gevormd worden met de nieuwe isolaten.

Om een beeld te krijgen van de moleculaire processen die specifiek bijdragen tot de vorming van de biofilmen in het modelsysteem, zal het CMPG genexpressie studies uitvoeren op deze biofilmen. D.m.v. qRT-PCR en genreporterfusies zal de expressie gevolgd worden tijdens de biofilmvorming van genen rechtstreeks betrokken in de matrixproductie, genen coderend voor regulatorische mechanismen, en genen die onrechtstreeks betrokken zijn in matrixproductie en biofilmregulatie (o.a. metabole genen, genen voor celwand componenten, …). De bekomen expressieprofielen zullen steeds vergeleken worden met deze in vrijlevende toestand. De keuze van de bestudeerde genen zal gebaseerd worden op literatuurgegevens en in-house data. Een aantal van deze genen zal geconserveerd zijn in de verschillende bacteriesoorten in de biofilmen; andere genen zullen uniek zijn voor bepaalde soorten. Door gebruik te maken van species-specifieke qRT-PCR primers en verschillende types van genreporters (e.g. GFP, DsRed.T4) kan de expressie van de geconserveerde genen voor elke bacteriesoort in de biofilm afzonderlijk bepaald worden. FACS-analyse (fluorescence activated cell sorting) in combinatie met fluorescentie genreporterfusies laat toe om de genexpressie te bestuderen op single cell niveau, terwijl fluorescentiemicroscopie een beeld kan bieden van het ruimtelijk patroon van genexpressie. Om de resultaten van de genexpressie studie te valideren zullen voor genen die sterk op- of ondergereguleerd zijn in de biofilmen, knock-out mutanten en overexpressieconstructen geconstrueerd worden. Deze zullen worden geëvalueerd in biofilmtesten en een aantal andere fenotypische testen (bv. kleuring van matrix componenten, flagellenkleuring, zwemtest).

Op basis van de geobserveerde expressieprofielen worden innovatieve biofilm-inhibitoren gesuggereerd, die geïmplementeerd kunnen worden in de desinfectieprotocols van werkpakket 3. Deze inhibitoren kunnen reeds gekende en gekarakteriseerde componenten zijn, die een nieuwe toepassing vinden in biofilm bestrijding (b.v. inhibitoren van bepaalde metabole processen). Anderzijds heeft het CMPG een aantal nieuwe klassen van biofilm-inhibitoren onder ontwikkeling, waarvan de werkingsmechanismen goed gekarakteriseerd zijn. Bovendien zijn uitgebreide in vitro en in silico screeningplatforms beschikbaar voor de identificatie van nieuwe inhibitoren voor specifieke moleculaire processen.

Werkpakket 3: Optimalisatie reinigings- en desinfectieproducedure

In werkpakket 3 zal een evaluatie gemaakt worden van optimale verwijderingstechnieken voor biofilmen in de deelnemende levensmiddelenbedrijven. De huidige werkwijze en zijn specifieke effectiviteit voor de verwijdering van biofilmen zal in de deelnemende bedrijven geïnventariseerd worden. Hierbij zal gebruik gemaakt worden van de praktisch toepasbare detectiemethodes voor biofilmen die in werkpakket 1 geëvalueerd werden. Ook specifieke detectie voor aanwezigheid van mogelijke biofilmen bij CIP (Cleaning-In-Place) processen en installaties komen hierbij aan bod. Vervolgens zullen o.a. op basis van de reeds binnen het consortium opgebouwde kennis rond reiniging en ontsmetting en de internationaal beschikbare kennis (sectoroverschrijdend) een doelgerichte verwijdering van de opgespoorde biofilmen bestudeerd worden met aandacht voor zowel chemische reiniging, enzymatische reiniging, innovatieve technieken zoals ultrasonische reiniging alsook waar nodig met aandacht voor hygiënisch ontwerp en anti-microbiële oppervlakken. Hierbij zullen naast praktijkinterventies ook testopstellingen (bv. labo of in de Food Pilot) gebruikt worden wanneer de mogelijkheid zich hiervoor aanbiedt. Daarnaast zal ook ondersteuning gezocht worden bij toeleveringsbedrijven in het gebied van R&O (leveranciers van reinigingstechnieken, desinfectietechnieken en middelen),

De wetenschappelijke kennis verworven in werkpakket 1 omtrent de karakteristieken van de biofilm en werkpakket 2 rond het mechanisme van biofilmvorming moeten eveneens bijdragen tot een effectievere manier van behandeling en verwijdering van een biofilm. De invloed van de reinigings- en desinfectieprocedure op de expressie van cruciale biofilm-genen zal gevolgd worden in functie van de tijd door gebruik te maken van fluorescente genreporterfusies (in combinatie met fluorescentiemicrocopie, fluorescentiemeting in microtiterplaten en/of FACS-analyse) (werkpakket 2).

Expressie van biofilmgerelateerde genen en afbraak van de EPS (extracellulaire polysacchariden) laag tijdens diverse verwijderingstechnieken wordt bestudeerd, rekening houdend met het type bederforganisme in de biofilm en het type oppervlak (roestvrij staal, kunststof, …) (werkpakket 2).

Werkpakket 4: Richtlijnen voor het voorkomen van biofilmvorming

Tot slot worden in werkpakket 4 op basis van de bekomen resultaten praktische richtlijnen voor de levensmiddelenindustrie geformuleerd ter verwijdering en preventie van biofilmen. Er zal hierbij aandacht besteed worden aan o. a. materiaalkeuze, hygiënisch ontwerp, verwijderingstechnieken en wijze van verificatie

Verwachte resultaten en toegevoegde waarde voor de bedrijven

Bacterieel bederf is een belangrijk aandachtspunt voor de voedingsindustrie met duidelijke economische gevolgen door o.a. productverlies. Daarnaast zal bederf vaak hand in hand gaan met de aanwezigheid van pathogenen wat de volksgezondheid in het gedrang kan brengen met eventueel sterke imagoschade voor het bedrijf of merk in kwestie. Er wordt geschat dat contaminatie van machines en apparatuur verantwoordelijk zijn voor 40% van de voedselgerelateerde bacteriële uitbraken in Frankrijk (Haeghebaert et al., 2001). De US National Health Institute (NHI) en Centers for Disease Control and Prevention (CDC) halen aan dat 65 % van alle microbiële ziekten toe te schrijven zijn aan biofilmvorming (Potera, 1999).

Binnen de US wordt geschat dat biofilmen verantwoordelijk zijn voor 38 miljard dollar verlies ten gevolge van corrosie schade, verlies aan product en extra onderhoud aan machines (e.g. extra reiniging en vervangen van onderdelen) (Haile & Nakhla, 2010).

De verwachte resultaten van het onderzoeksprogramma zijn :

  • Isolatie en identificatie van belangrijke biofilmvormers, en dit sectorspecifiek
  • Opbouw van een reproduceerbaar modelsysteem voor aanmaak van biofilmen
  • Inzicht in genetische wijzigingen in biofilmen
  • Optimale inhibitorproducten voor biofilmvorming
  • Geoptimaliseerde detectiemethodes voor biofilmen
  • Innovatieve en effectieve technieken voor verwijdering van biofilmen
  • Leidraad met praktische richtlijnen

Doelgroep bedrijven/sectoren

Voorliggend project richt zich zowel tot voedingsbedrijven met sterk bederfbare producten (zuivel, vleeswaren, kant- en klare maaltijden, brouwerij, sausen en salades, voorversneden producten,…) als tot bedrijven gespecialiseerd in aanmaak van reinigingsmiddelen, reiniging, inspectie en hygiëneopvolging.

Aanvragers

Projectleider: KaHo Sint-Lieven Gent, Laboratorium voor Enzym, Fermentatie- en Brouwerijtechnologie – Prof. Alex Verplaetse

Partners: UGent-IBM en UGent-LM – Prof. Katleen Raes – Prof. Peter Vandamme

KU Leuven, Centre of Microbial and Plant Genetics - Prof Jos Vanderleyden en Dr. Hans Steenackers

ILVO, Eenheid Technologie & Voeding-onderzoeksdomein Voedselveiligheid – Dr. ir. Koen De Reu en Prof. Marc Heyndrickx

Relevante sectoren

Zuivelindustrie ; vlees- en slicingindustrie ; kant- en klaremaaltijden ; sausen en salades ; brouwerij ; reiniging- en desinfectieleveranciers.

Deelnemen

Het project is gestart op 1 januari 2014 en loopt tot 31 december 2016 (projectduur 3 jaar), tot die tijd is steeds een deelname mogelijk. Nadien kunnen de resultaten opgevraagd worden (mits betaling). Voor meer info en tarief voor deelname, neemt u best contact op met de projectbeheerder (Stefan Coghe).