Projecten

PROMILK

Ontwikkeling en toepassing van een snelle methode voor de kwantificatie van de thermoresistente, bacteriële, proteolytische activiteit in rauwe melk

OPPORTUNITEIT & PROBLEEMSTELLING

Bij gekoelde bewaring van rauwe melk op de hoeve en in het zuivelbedrijf vóór het verwerkingsproces wordt de groei bevorderd van psychrotrofe micro-organismen, vnl. behorend tot de pseudomonaden. Dit kan aanleiding geven tot vorming van hitteresistente bederfenzymen. Alhoewel de UHT-verhitting of sterilisatie de micro-organismen afdoodt, blijven deze enzymen actief en kunnen ze in UHT- en gesteriliseerde melk- en zuivelproducten bij bewaring oorzaak zijn van smaak- en stabiliteitsproblemen vóór het bereiken van de houdbaarheidsdatum. Tevens kunnen deze enzymen een negatieve invloed hebben op kaasrijping. Kwaliteitsproblemen vóór het verstrijken van de houdbaarheidstermijn leiden tot klachten en mogelijk ook tot een recall van de betrokken producten. Dit heeft niet alleen een aanzienlijke financiële schade tot gevolg, maar is bovendien ook schadelijk voor de reputatie van de producent.

Voorliggend project heeft als globale doelstelling een snelle en eenvoudige methode te ontwikkelen waarmee de hitteresistente proteolytische kwaliteit van rauwe melk snel kan ingeschat worden. Een dergelijke methode zal de producent in staat stellen om het melkverwerkingstraject en de bestemming van het eindproduct aan te passen aan de proteolytische kwaliteit van de melk. Door deze kennis kunnen de bedrijven het risico op klachten en op een recall tot een absoluut minimum beperken. Hiernaast zal dit project ook meer kennis genereren over de Pseudomonas-problematiek in kaas. Deze kennis kan door de zuivelindustrie gebruikt worden om hun productieprocessen aan te passen. Ten slotte zal in dit project ook een preventieve aanpak van het Pseudomonas-probleem in rauwe melk onderzocht worden, nl. de voorbehandeling van spenen/desinfectie van tepelvoeringen met innovatieve natuurlijke middelen die geen risico vormen voor residuen in de rauwe melk. Dit kan een reële mogelijkheid betekenen voor producenten van reinigings- en desinfectiemiddelen om hun afzetmarkt te vergroten en voor de zuivelsector om de enzymatische kwaliteit van de rauwe melk te verbeteren.

Doelgroepbedrijven en -sectoren

De reële doelgroep bestaat uit bedrijven van de melk- en zuivelsector, zijnde in de eerste plaats producenten van UHT-melk, en producenten van gerijpte kaas. Tot de ruime doelgroep behoren voornamelijk de producenten en leveranciers van reinigings- en desinfectieproducenten gericht op hygiëne tijdens melkproductie, alsook producenten en verdelers van analyseapparatuur.

UITVOERDERS

De ILVO-afdeling Technologie & Voeding te Melle beschikt als voormalig Rijkszuivelstation over een decennialange expertise in onderzoek van melk en melkproducten. De onderzoeksleiders van dit project beschikken over een wereldwijd erkende expertise in het kader van het voorgestelde onderzoek. Deze expertise wordt aangetoond via diverse publicaties (6 peer reviewed wetenschappelijke artikels sinds 2007, met 69 citaties op 6/7/2015; 2 hoofdstukken in boeken o.a. in Improving quality in milk products, Woodhead Publishing Ltd., Cambridge, UK. ISBN 978-1-84569-806-5), internationale samenwerkingen (Italië, Brazilië, Nederland) en in de dagelijkse werking van het ILVO-T&V in het kader van dienstverlening en referentiewerking. Onderzoek rond bederf in melk en meer bepaald hitteresistente proteasen werd uitgevoerd in het doctoraat van Sophie Marchand en Valerie De Jonghe onder leiding van Dr. Jan De Block en Prof. Dr. Marc Heyndrickx. De klassieke TNBS-methode wordt veelvuldig gebruikt in het geaccrediteerde labo voor de enzymatische kwaliteitsbepaling van melk en andere zuivelproducten. Ook is een uitgebreide collectie aan Pseudomonas-stammen voorhanden die hitteresistentie protease produceren. Tevens beschikt ILVO over een HRMS-toestel waarmee peptideprofielen kunnen worden geanalyseerd. Dit toestel wordt bediend en de resultaten ervan geïnterpreteerd door Dr. Christoph Van Poucke, die zijn expertise ter beschikking zal stellen voor dit project. De hoge resolutie massaspectrometer (HRMS) beschikbaar binnen ILVO is een Acquity UPLC gekoppeld aan een Synapt G2-S massaspectrometer. Deze configuratie laat toe om componenten te scheiden op basis van polariteit (retentietijd- UPLC), massa over lading verhouding (MS), grootte en vorm (ionen mobiliteit, HDMS). Een combinatie die de identificatie van peptiden en het opstellen van peptideprofielen vergemakkelijkt. Daarnaast zal Dr. Els Van Coillie, ILVO-aanspreekpunt voor houdbaarheidsonderzoek voor voedingsbedrijven, ook haar specfieke expertise inbrengen. Tevens zal beroep worden gedaan op de aanwezige kennis op vlak van melkvee en relatie dier/techniek (Dr. Stephanie Van Weyenberg).

 

Resultaten

Het huidige project had als globale doelstelling een snelle en eenvoudige methode te ontwikkelen waarmee de hitteresistente proteolytische kwaliteit van rauwe melk snel kan ingeschat worden. Een dergelijke methode zal de producent in staat stellen om het melkverwerkingstraject en de bestemming van het eindproduct aan te passen aan de proteolytische kwaliteit van de melk. 

In het eerste werkpakket werd aan deze methodologie gewerkt. Het eerste luik omvatte het optimaliseren van de staalvoorbereiding. Rauwe melk is een complexe matrix met een overvloed aan proteïnen en peptiden, die kunnen interfereren bij detectie van nieuwgevormde peptiden. De staalvoorbereiding die op punt gezet werd, omvat verschillende stappen waaronder centrifugeren, membraanfiltratie, incuberen bij 37°C en een in house ontwikkeld concentratieprotocol.

In een tweede luik werd de detectiemethodologie op punt gesteld. Er werden drie commerciële kits geëvalueerd (twee voor de detectie/kwantificatie van peptiden en één voor de detectie/kwantificatie van proteolytische activiteit). Geen enkele kit werd weerhouden. Beide kits voor detectie/kwantificatie van peptiden konden geen verschillen detecteren tussen het niet-geïncubeerd en geïncubeerd staal. De kit voor detectie/kwantificatie van de proteolytische activiteit werd niet weerhouden wegens technische problemen. Daarnaast werd er een HRMS-methode op punt gesteld en gevalideerd voor de detectie van proteolytische activiteit in kunstmatig besmette stalen. Hierbij werden er zes merkerpeptiden geselecteerd waarvan de concentratie toenam. De detectielimiet van de HRMS-methode bleek niet gevoelig genoeg voor detectie/kwantificatie van de merkerpeptiden in natuurlijk besmette stalen. Er werd ter vervanging een LC-MS/MS methode geoptimaliseerd, die nog gevalideerd moet worden.

Het tweede werkpakket omvatte het genereren van kennis over de Pseudomonas-problematiek. Tijdens een eerste deel werd er gezocht naar een relatie tussen het aantal pseudomonaden in rauwe melk en de proteolytische activiteit teruggevonden in de stalen. Het was zeer moeilijk om een verband te vinden tussen de Pseudomonas aantallen, de proteolytische activiteit en de melkstabiliteit. Hoge Pseudomonas aantallen zorgden niet altijd voor proteolytische activiteit en omgekeerd. In het tweede deel werd onderzocht of analyse van het rauwe melkaroma via SIFT-MS mogelijkheden biedt voor snelle kwantificatie van Pseudomonas groei in rauwe melk. Tijdens het derde deel werd een preventieve aanpak voor het Pseudomonas-probleem in rauwe melk onderzocht, nl. de voorbehandeling van spenen en desinfectie van tepelvoeringen met innovatieve natuurlijke middelen die geen risico vormen voor residuen in de rauwe melk. Hiervoor werden 10 koeien van verschillende pariteiten geselecteerd uit de proefkudde van het ILVO. De proef duurde negen dagen, met een drie dagen durende controle periode (standaard behandeling van spenenreiniging) en een zes dagen durende behandelingsperiode (standaard + toepassen van het reinigings- en ontsmettingsschuim – beide melkbeurten). Tijdens de eerste melkbeurt werden de dieren bemonsterd na de standaard behandeling en, indien toegepast, na schuimbehandeling. Van alle stalen werd het mesofiel en (proteolytisch) psychrotroof kiemgetal bepaald. Daarnaast werden ook stalen genomen van de melkklauwen voor en na desinfectie. Telkens werd het effect op het mesofiel en proteolytisch psychrotroof kiemgetal gemeten, ook de proteolytische activiteit werd bepaald. De meerderheid van de proteolytische isolaten behoorden tot de pseudomonaden. 

Het derde werkpakket waarbij het effect van de proteolytische activiteit op de kaasrijping bepaald ging worden, werd wegens tijdsgebrek ingeperkt. In dit werkpakket werd er een protocol op punt gesteld, waarbij peptiden aanwezig in kaas met HRMS gedetecteerd konden worden.

Deelnemen

Het project is gestart op 1 mei 2016 en liep tot 28 februari 2018. De resultaten kunnen opgevraagd worden (mits betaling). Voor meer info en tarief, neemt u best contact op met de projectbeheerder (Ellen Fierens).