DNA sequentieanalyse gaat steeds sneller en massaler. De technologie is niet langer onbereikbaar voor de voedingsindustrie. Toepassingen duiken op in de voedingsmicrobiologie: gaande van ondersteuning bij product- en procesontwikkeling tot acuut incident management.
In de voedingsindustrie worden heel wat microbiologische analyses uitgevoerd, bijvoorbeeld voor het garanderen van voedselveiligheid, het inschatten van de kwaliteit en de houdbaarheid van producten, het monitoren van hygiënemaatregelen en reinigingsprocedures, het opvolgen van fermentatieprocessen, etc. Vaak krijgt men daarbij te maken met een heterogene set van micro-organismen die samen voorkomen: een microbieel ecosysteem (ook microbiota genoemd). Om deze micro-organismen te detecteren, identificeren en monitoren wordt klassiek gebruik gemaakt van ‘cultuurafhankelijke’ methoden waarbij micro-organismen opgekweekt dienen te worden op voedingsbodems vooraleer overgegaan kan worden tot de feitelijke microbiologische analyses. Deze benadering is niet enkel arbeids- en tijdsintensief, maar kent ook een bias daar verschillende bacteriën, gisten en schimmels zich niet ‘in cultuur laten brengen’.
Via ‘high-throughput sequencing’ (HTS) kan een doorgedreven en gedetailleerde analyse van de samenstelling van het microbiële ecosysteem uitgevoerd worden op een ‘cultuuronafhankelijke’ manier. Deze technologie omvat de isolatie van DNA uit een staal (bv. een voedingsproduct) en een daaropvolgende rechtstreekse DNA sequentiebepaling van duizenden korte DNA fragmenten in één enkele analyse. Vergelijking met referentie DNA sequentiedatabanken laat dan toe om de DNA fragmenten toe te wijzen aan specifieke organismen. Omdat voeding samengesteld is uit dierlijke of plantaardige grondstoffen (en dus ook hun DNA bevat), dient de DNA sequentieanalyse zich toe te spitsen op DNA fragmenten die specifiek afkomstig zijn van de micro-organismen. De huidige toepassingen van HTS voor microbiota analyse in voeding richten zich naar DNA-sequenering van fragmenten van 16S rRNA genen, die voorkomen in alle micro-organismen en hypervariabele zones bevatten die van soort tot soort verschillen. Er bestaan goed uitgebouwde referentie DNA sequentiedatabanken van. In de praktijk worden de hypervariabele DNA fragmenten van deze genen specifiek verkregen en aangerijkt (tot zogenaamde amplicons) via de PCR (polymerasekettingreactie) techniek.
|
HTS toepassingen in onderzoek
De meeste HTS toepassingen in het onderzoek zijn erop gericht om beter inzicht te krijgen in voedingsfermentatieprocessen en voedselbederf. Hierbij wordt de microbiota samenstelling en zijn evolutie in de tijd opgevolgd.
Gefermenteerde levensmiddelen
16S rRNA amplicon HTS is een krachtig middel om microbiële dynamica in natuurlijke fermentaties op te volgen of na te gaan of starterculturen de fermentatie domineren.
Verschillende studies op kazen illustreren de mogelijkheden van 16S rRNA amplicon HTS. Zo toonden deze duidelijk de verschillen in de microbiële samenstelling in functie van:
- De soort melk: koemelk versus geitenmelk, versus schapenmelk
- Gepasteuriseerde versus rauwe melk
- De zoutconcentratie: hoge concentraties reduceerde Leuconostoc en Pseudomonas
- De soort kaas: harde kazen (rijpere kazen) toonden een toename in Lactobacillus populaties
- De manier van bereiding: traditionele kazen toonden complexere microbiële samenstellingen
- De locatie binnen de kaas: kost, kern, aders, inclusies (bv. blauwe kazen)
Effect van condities op kwaliteit en houdbaarheid
Een andere toepassing van 16S rRNA amplicon HTS die in de literatuur opduikt is het nagaan van verschuivingen in bederf-geassocieerde micro-organismen bij wijzigende bewaaromstandigheden.
Zo bracht HTS bij een houdbaarheidstest (40 dagen) van vers rundvlees bij verschillende verpakkingswijzen het volgende aan het licht:
- Bij bewaring aan de lucht domineerden Brocothrix thermosphacta en Pseudomonas spp.
- Bij MAP-verpakking domineerden B. thermosphacta en Carnobacterium divergens
- Bij vacuüm-verpakking domineerden melkzuurbacteriën
- Bij een anti-bacteriële verpakking domineerde Carnobacterium divergens op het einde van de houdbaarheidstermijn
Hoe doorgedreven moet hts worden toegepast?
Gezien de performantie en de snelheid waarmee HTS kan worden uitgevoerd, leent de benadering zich er toe om een zeer groot aantal sequenties van verschillende voedingsstalen op korte tijd te sequeneren. De vraag die zich stelt is hoeveel DNA sequenties er per staal bepaald dienden te worden om een volledig en betrouwbaar zicht te krijgen op de samenstelling van het microbiële ecosysteem van het staal. Hierop kan ‘rarefaction’ analyse van de sequentiedata een antwoord bieden (Figuur 1). Als het aantal gedetecteerde soorten bij toenemende sequenties per staal begint af te vlakken dan heeft men een voldoende aantal sequenties bepaald. Algemeen kan men stellen dat artisanale producten of producten die gebaseerd zijn op rauwe grondstoffen complexere microbiota hebben en dus een groter aantal DNA sequenties vereisen.
Figuur 1 Voorbeeld van een rarefaction analyse [Bron: D. Ercolini, 2013]
Toepassing door bedrijven
Toepassing van HTS evolueert meer en meer naar een gebruiksvriendelijke technologie met een lage operationele kost. Doch blijft het toepassen een specialistenzaak, niet in het minst door de bioinformatica expertise die nodig is om de duizenden DNA sequenties om te zetten naar microbiologische informatie. Toch zijn er mogelijkheden voor bedrijven. In Vlaanderen wordt HTS door een beperkt aantal onderzoeksgroepen ingezet voor onderzoeksdoeleinden (ondermeer in een Flanders’ FOOD project). Verder startte een onafhankelijk kwaliteitslaboratorium vorig jaar als eerste met het aanbieden van HTS analyses op maat van voedingsbedrijven.
HTS in Flanders’ FOOD project
In INNOCERAL II (binnenkort opstartend) zal IMDO-VUB HTS aanwenden om de microbiële soortdiversiteit van zuurdesems te analyseren. Daar het belangrijk is om in dit soort onderzoek de soortdiversiteit met voldoende hoge resolutie te bepalen (tot op soort niveau), wordt er geopteerd voor een HTS platform dat langere DNA sequenties kan ‘lezen’.
HTS op maat van voedingsbedrijven
Quality Partner biedt verschillende HTS platformen aan, voor toepassingen als:
- Incident management op productniveau (bv. identificatie bederforganismen, pathogenen)
- Incident management op procesniveau (bv. identificatie contaminatiebronnen, biofilms)
- Ondersteuning bij productontwikkeling (bv. houdbaarheidsverlenging, impact samenstellingswijzigingen)
- Ondersteuning bij houdbaarheidstesten (bv. invloed verschillende types verpakking)
- Ondersteuning bij het op punt stellen van reinigings- en desinfectieprocedures
- Ondersteuning van R&D (bv. impact probiotica op darm microbiota, effect beschermende flora)
Bronnen
- D. Ercolini. (2013) High-throughput sequencing and metagenomics: moving forward in the culture-independent analysis of food microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology, 79, 3148-3155.
- Artikel 24/05/2012 Baanbrekende microbiologische analyse van voedingsmiddelen via ’metagenomics’
- Quality Partner: Laurent Delhalle en Maryse Bormans
Meer Info?
- Illumina Next-Generation Sequencing
- Life Technologies Ion Torrent PGM System
- Life Technologies SOLiD
- Roche 454 pyrosequencing
- Quality Partner: kwaliteitscontrole voor de agrovoedingssector
- INNOCEREAL II: Inovatieve fermentatiestrategieën om de aromavorming in bakkerijproducten te accentueren
