Toegankelijke challengetesten dankzij niet-toxische Clostridium botulinum stammen

Nood aan toegankelijkere challengetesten voor Clostridium botulinum: waarom?

Kant-en-klare maaltijden alsook gekoelde, bewerkte levensmiddelen zijn een snel groeiend segment op de markt. Ook de vraag naar clean-label producten stijgt, wat maakt dat voedingsbedrijven moeten blijven inzetten op innovaties in dit segment, zoals het gebruik van nieuwe eiwitbronnen, zout- en suikervermindering en het weglaten of vervangen van chemische conserveringsmiddelen door natuurlijke alternatieven. Dit mag echter niet ten koste gaan van de voedselveiligheid. Clostridium botulinum is daarbij één van de belangrijkste sporenvormers die in dergelijke producten onder controle moet gehouden worden. Deze grampositieve, anaerobe, sporenvormende bacterie is berucht voor de productie van botulinum neurotoxinen (BoNTs) die de verlammingsziekte botulisme kunnen veroorzaken. Dit micro-organisme vermenigvuldigt zich in zuurstofarme milieus (rottend organisch materiaal, sediment van stilstaand en stromend water…). De sporen van deze bacterie zijn veel resistenter tegen inactivatie door hitte, droogte, zuur, enz. in vergelijking met de vegetatieve (delende) vorm van de bacterie. Deze sporen kunnen voedingsmiddelen contamineren en op hun beurt weer uitgroeien tot vegetatieve, toxineproducerende cellen in vacuüm of MAP (modified atmosphere packaging) verpakte voedingsmiddelen. Het is dus van uiterst belang dat de samenstelling en behandeling van voedingsmiddelen bepaald wordt ofwel met oog op het elimineren van de aanwezige sporen, ofwel om de uitgroei van deze sporen tot vegetatieve cellen te verhinderen.

De klassieke challengetesten voor C. botulinum vereisen uitzonderlijke veiligheidsmaatregelen, specifieke anaerobe condities tijdens de analyses en gespecialiseerd personeel. Bovendien bestaat er geen selectieve groeibodem voor C. botulinum, wat de betrouwbaarheid van plaattellingen niet ten goede komt. 

In het BotulinSafe project werd gezocht naar toegankelijkere challengetesten door de ontwikkeling van groep II (niet-proteolytische) C. botulinum stammen die:

1. niet toxisch zijn maar wel in hun andere eigenschappen gelijken op de toxische varianten
2. gemakkelijk kunnen worden geteld op een selectief uitplatingsmedium

Resultaten BotulinSafe: Ontwikkeling van gemerkte, niet-toxische stammen

Vertrekkende van 83 omgevings- en voedingsstalen werden 31 groep II C. botulinum isolaten fenotypisch en genomisch onderzocht. De genomische analyse op basis van de Whole Genome Sequencing van de stammen bevestigde de afwezigheid van BoNT toxinegenen en de verwantschap van de isolaten met de fylogenetische lijnen van toxische stammen. Het onderzoek toonde aan dat de tolerantie van deze stammen ten opzichte van zout-, zuur- en lage-temperatuurstress gelijkaardig was met die van toxische stammen, net als de hitteresistentie van de sporen. Samen tonen deze resultaten aan dat, afgezien van de aanwezigheid van een BoNT toxine-gen, de niet-toxische en toxische groep II C. botulinum stammen genetisch en fenotypisch niet te onderscheiden zijn.

Op basis van deze genomische en fenotypische karakterisering werden vijf stammen geselecteerd voor de samenstelling van een stammencocktail voor toepassing in challengetesten (tabel 1). De cocktail omvat ten minste één stam met een hoge resistentie tegen lage pH, lage temperatuur en hoge zoutconcentratie, en tenminste één stam met zeer hitteresistente sporen. Voorts zijn de twee fylogenetische lijnen vertegenwoordigd. Deze zouden namelijk kunnen verschillen in bepaalde groei- of overlevingseigenschappen die in deze studie niet werden getest, maar die relevant kunnen zijn voor specifieke voedingsmiddelen. Tenslotte vertonen de geselecteerde stammen geen onderlinge kruisremming. ZBS3 werd gekozen om de cluster van type E te vertegenwoordigen, aangezien de enige andere niet-toxische stam uit deze cluster (DSM1985) antagonistisch was voor de meeste andere stammen. ME22 en VAP51 werden opgenomen vanwege hun goede groei bij lage temperatuur, ZBS4 vanwege zijn zouttolerantie en CH2 voor zijn resistentie tegen lage pH en zijn hitteresistente sporen.

Selectief medium voor challengetesten

Deze vijf niet-toxische stammen werden bovendien uitgerust met een genomische erythromycine (Em) resistentiemerker. Dankzij deze merker wordt het tellen van de niet-toxische stammen vergemakkelijkt in challengetesten, aangezien Em toegevoegd kan worden aan het uitplatingsmedium om de selectiviteit te verhogen. Behalve Em werd er ook cycloserine (Cs) en gentamicin (Gm) toegevoegd aan het selectieve medium, omdat C. botulinum net als vele andere clostridia daar van nature resistent tegen zijn.

Om de effectiviteit van dit selectief medium te valideren, werd in een experiment de uitplatingsefficiëntie van de vijf niet-toxische stammen geëvalueerd op het selectieve medium en vergeleken met deze op het medium zonder antibiotica. Dit werd gedaan voor elke stam afzonderlijk, met de cocktail van vijf stammen en zowel met sporensuspensies als suspensies van vegetatieve cellen (figuur 1). De uitplatingsefficiëntie van de vegetatieve cellen op het niet-selectieve en selectieve medium was niet te onderscheiden voor elke individuele stam en voor de stammencocktail. Daarentegen waren de tellingen van de sporensuspensies 0,5 - 1,7 log kve/ml lager op het selectieve medium, afhankelijk van de stam. Alhoewel de verschillen niet altijd significant waren. Een langere incubatietijd leidde niet tot een toename van de tellingen op het selectieve medium. De lagere uitplatingsefficiëntie van de sporen suggereert dat de antibioticacocktail op de een of andere manier interfereert met de kieming van de sporen. Daarom werd het selectieve medium extra aangevuld met lysozym in een poging om de kieming van de sporen te stimuleren. Uit de resultaten in figuur 1 blijkt dat lysozym inderdaad de uitplatingsefficiëntie van de sporensuspensies voor alle stammen verhoogt. Voor drie stammen was de uitplatingsefficiëntie terug op het niveau van het niet-selectieve medium, voor één stam was deze nog iets lager (0,4 log kve/ml), en voor één stam was deze zelfs nog hoger. Dit laatste zou te wijten kunnen zijn aan een superdormante fractie die zelfs op het RCM medium niet kiemt zonder de hulp van de toegevoegde lysozym.

Een test met commerciële kookham toonde aan dat dit selectief medium  de achtergrondmicrobiota efficiënt onderdrukt, maar tegelijk de sporenkieming en de groei van de Em-resistente surrogaatstammen toelaat. Hoewel deze niet-toxische surrogaatstammen en het selectief medium nog gevalideerd moeten worden in grootschalige challengetesten, verwacht men dat deze stammen en het bijhorende selectieve medium de uitvoering van challengetesten veiliger, gemakkelijker, betrouwbaarder en dus toegankelijker zal maken voor de voedingsindustrie.

Bronnen

Poortmans, M.; Vanoirbeek, K.; Dorner, M.B.; Michiels, C.W. Selection and Development of Nontoxic Nonproteolytic Clostridium botulinum Surrogate Strains for Food Challenge Testing. Foods 2022, 11, 1577. https://doi.org/10.3390/ foods11111577